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鑲嵌蛋白pir1呈現脂肪酶於酵母菌細胞壁表面及高度表現脂肪酶之酵母菌株

分生所    劉宏仁教授 

脂肪酶 (lipase) 是普遍存在於生物界之一種酵素，包括微生物、植物及動物界。藉由飼料中添加適量微生物亦能提升其它受質之消化及吸收。目前市售酵素多以大腸桿菌表現系統進行量產，而該系統容易產生包含體，導致未 正確摺疊之酵素不具活性，且需純化去除大腸桿菌產生之內毒素。為增加仔豬對飼料營養成分之吸收，防止因抗營養因子消化不良所引起之下痢，透過飼料添加酵素可改善此現象。本研究研發酵母菌表面呈現系統 (yeast surface-displayed system)將酵素經由酵母細胞壁鑲嵌蛋白 pir1 呈現於酵母菌表面，因此酵母菌表現之酵素可直接添加於飼料。結合先前研發之低濃度 0.005% 葡萄糖誘導啟動子 (GTH1 promoter)，改善傳統嗜甲醇巴斯德畢赤酵母菌 (Pichia pastoris)需利用昂貴及高危險性之甲醇作為誘導劑之缺點，可減少誘導期間所需碳源及誘導劑，達降低生產成本之目的。此外，為提升脂肪酶之表現量，將目標基因序列優化及建構兩套及四套之多套表面呈現之載體，以提升酵素產量及符合產業化需求。線性質體 DNA 電穿孔於 P. pastoris GS115，以 2000 μg /ml 之高濃度 Zeocin挑選高度同源重組菌株，經 0.005% 葡萄糖誘導 72小時後，以免疫螢光染色法及西方墨點法確認酵素表現。在活性分析結果發現以四套表現載體之轉殖株較單套提升2至4倍之活性，證實套數與酵素活性成正向關係。脂肪酶之生化活性分析結果顯示，兩者之最佳反應溫度分別為 85℃ 及適反應 pH 7.0，而在55℃ 至 85℃ 之熱穩定性及 pH 3.0 至 pH 8.0耐受性處理後，仍具有活性；於腸胃道環境模擬測試，在 0.5% pepsin 及 0.5% trypsin作用後，皆仍維持高活性。因此本研究建立之 P. pastoris 表面呈現系統，不僅大幅減少蛋白量產步驟降低生產成本，具產業化價值。

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改良型耐高溫脂肪酶

分生所    劉宏仁教授 

脂肪酶 (lipase) 是普遍存在於生物界之一種酵素，包括微生物、植物及動物界。藉由飼料中添加適量微生物亦能提升其它受質之消化及吸收。動物飼料添加酵素，在飼料加工造粒時有一高溫 (80-90°C) 處理過程。若酵素可耐高溫及活性可穩定維持，可提高利用性及商業化價值。以原核表達系統表現定點基因突變之重組 lipase 蛋白，經 SDS-PAGE 及以西方墨點法 (Western blot) 確認重組蛋白。此lipase具耐熱性及酸鹼 (25-90°C 及 pH 4-10 皆具活性)。 Lipase is an enzyme commonly found in the biosphere. There are a variety of enzymes which is derived from microorganisms including fungi and bacteria. To make the addition of the enzymes to animal feed, it must be processed in a high temperature (80-90°C). If the enzyme activity can be stably maintained in the process, its utilization and commericalized value will be increased. The gene of lipase was point mutated and expressed in E. coli expression system and the expressed protein was examined by SDS-PAGE and Western blot assays. We found that the lipase is heat- and acid-resistant.

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耐高溫及耐酸之脂肪酶

分生所    劉宏仁教授 

脂肪酶 (lipase) 是普遍存在於生物界之一種酵素，包括微生物、植物及動物界。藉由飼料中添加適量微生物亦能提升其它受質之消化及吸收。動物飼料添加酵素，在飼料加工造粒時有一高溫 (90°C) 處理過程。若酵素可耐高溫及活性可穩定維持，則可提高其利用性及商業化價值。利用原核表達系統表現重組 lipase 蛋白，經 SDS-PAGE 及以西方墨點法 (Western blot) 確認重組蛋白。此lipase具耐熱性及酸鹼 (25-90°C 及 pH 4-10 皆具活性)。

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犬腺病毒單株抗體應用於研發犬腺病毒之快篩試紙

分生所    劉宏仁教授 

犬腺病毒（Canine adenovirus, CAV）則屬於不具封套之雙股DNA病毒，會引起犬類傳染性肝炎。CAV之hexon蛋白是病毒之表面蛋白，因此CAV hexon蛋白之單株抗體可用於研發快速檢測犬隻CAV 之immunochromatography test (ICT) strip。

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犬小病毒單株抗體應用於研發犬小病毒之快篩試紙

分生所    劉宏仁教授 

犬小病毒（Canine parvovirus, CPV）是不具封套之單股DNA 病毒，主要感染犬腸胃道。CPV之VP2蛋白是病毒之表面蛋白，因此CPV VP2蛋白之單株抗體可用於研發快速檢測犬隻CPV之immunochromatography test (ICT) strip。

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三株辨識結核分枝桿菌MPT64蛋白之單株抗體及pET32a-MPT64質體

分生所    劉宏仁教授 

肺結核桿菌之危害是我國及新興國家當前流行病的首要難題。為了研發一套快速檢測結核分枝桿菌之免疫層析快篩試紙(immunochromatographic strip；ICT strip)。因此將mycobacterium tuberculosis H37Rv 株之MPT64基因選殖於 pET32a vector及建構重組pET32a-MPT64質體DNA。以大腸桿菌表現MPT64蛋白。表現蛋白經蛋白電泳及Western blot分析證實MPT64蛋白之抗原性及進一步成功取得三株高特異性及敏感度之抗MPT64蛋白單株抗體，可作為研發TB免疫層析快篩試紙之關鍵材料。

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感染犬隻重要病毒之單株抗體及蛋白質表現質體

分生所    劉宏仁教授 

犬小病毒、犬瘟熱病毒、犬腺病毒及犬副流行性感冒病毒是感染犬隻之重要病毒。已建構大腸桿菌表現系統表現犬小病毒VP2蛋白、犬瘟熱病毒H蛋白、犬腺狀病毒fiber蛋白及犬副流行性感冒病毒HN蛋白以及取得上述 犬小病毒VP2蛋白、犬瘟熱病毒H蛋白、犬腺狀病毒fiber蛋白及犬副流行性感冒病毒HN蛋白之特異單株抗體。上述之特異單株抗體及表現之蛋白可用於研製快速檢測感染犬隻之病毒之免疫層析檢測 (immunochromatographic test；ICT)套組。

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桿狀病毒呈現載體pBacDD-4Cap(d41) 及基因重組桿狀病毒BacDD-4Cap(d41)

分生所    劉宏仁教授 

已建構桿狀病毒呈現載體pBacDD-4Cap(d41) 及基因重組桿狀病毒BacDD-4Cap(d41)。以基因重組桿狀病毒BacDD-4Cap(d41)呈現豬環狀病毒二型（PCV2）之cap 蛋白於細胞。在小鼠免疫試驗，取基因重組桿狀病毒BacDD-4Cap(d41)感染之細胞，分別含不同細胞數(107、106及105)作為抗原，經免疫後於ELISA分析證實4Cap(d41)疫苗及市售疫苗均可於小鼠有效誘發免疫反應。經病毒中和試驗證實Cap(d41)蛋白能誘發中和抗體生成。經IFN-γ ELISA證實4Cap(d41)疫苗能於小鼠產生細胞性免疫反應。在SPF豬隻免疫試驗，4Cap(d41) 疫苗，經免疫後於ELISA分析與病毒中和試驗證實可於豬隻有效誘發免疫反應。豬淋巴細胞增殖試驗顯示4Cap(d41)疫苗組可誘導顯著之細胞性免疫反應。經流式細胞儀分析顯示4Cap(d41)疫苗組之CD4+ T細胞百分比及CD4+/CD8+比值顯著提高，另外再以市售IFN-γ 及IL-4 ELISA檢測證實4Cap(d41)疫苗確實能於豬隻產生細胞性免疫反應。攻毒試驗顯示4Cap(d41)疫苗組比對照組顯著降低PCV2所引起之病毒血症。

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